MỞ ĐẦU

            Ngày nay với sự phát triển của khoa học kĩ thuật, chúng ta đã một cơ sở lí thuyết đầy đủ về màu sắc và đã chế tạo ra được các loại phẩm màu phong phú, đẹp và bền màu phục vụ cho nhu cầu về màu sắc của con người. Bên cạnh đó, các loại hợp chất màu tự nhiên với những ưu điểm riêng của nó vẫn luôn dành được sự quan tâm nghiên cứu của các nhà khoa học. So với phẩm màu nhân tạo thì phẩm màu thiên nhiên với ưu điểm nổi bật là không độc hại đã chiếm ưu thế vượt trội  trong ngành công nghệ thực phẩm. Màu đỏ tươi của hạt điều đã trở thành một loại thương phẩm quan trọng trong công nghệ màu sắc thực phẩm, màu xanh của lá gai, lá bồ ngót… được sử dụng rông rãi trong dân gian để làm bánh, mức, màu đen của đỗ đen, màu tím của khoai môn v v…được sử dụng rất đa dạng mang lại giá trị thẩm mĩ, giá trị kinh tế cao. Cùng với giá trị thẩm mĩ, một số hợp chất màu tự nhiên còn có giá trị to lớn hơn, đặc biệt là khả năng chống oxi hóa, bảo vệ sức khỏe con người.

1. 1. Đặc điểm chung

Đây là nhóm sắc tố có vai trò quan trọng nhất đối với quang hợp, vì nó có khả năng hấp thụ trực tiếp ánh sáng và biến năng lượng hấp thụ được - năng lượng vật lí thành năng lượng dự trữ trong các hợp chất hữu cơ - năng lượng hoá học. Các nhóm sắc tố khác không làm được chức năng đầy đủ và trực tiếp như vậy.

Có nhiều loại clorophin và sự khác nhau giữa chúng chỉ ở một số chi tiết về cấu tạo và sau đó là về điểm cực đại trong quang phổ hấp thụ ánh sáng.

Về cấu tạo chung của clorophin, ta chú ý đến các đặc điểm sau: phân tử clorophin có 4 nhân pyron liên kết với nhau bằng các cầu nối metyl ( - CH = ) để tạo nên vòng porphyrin có nguyên tử Mg ở giữa liên kết với 4 nguyên tử N của các nhân pyron, có hai nguyên tử H ở nhân pyron thứ tư, nhân này nối với gốc rượu phyton và có vòng cyclopentan ở nhân pyron thứ ba với một nguyên tử oxi.

Sau đây là công thức tổng quát của clorophin a và clorophin b:

            Clorophin a: C₅₅H₇₂O₅N₄Mg

            Clorophin b: C₅₅H₇₀O₆N₄Mg

Trong công thức cấu tạo, phân tử clorophin có nhiều nối đôi cách đều. Đó là kiểu nối đôi thể hiện khả năng hấp thụ mạnh năng lượng ánh sáng và dễ dàng bị kích thích bởi ánh sáng, cũng như dễ dàng chuyển năng lượng ánh sáng hấp thụ được cho các phản ứng quang hoá.

1.2. Một số tính chất hoá học và vật lí của clorophin:

1.2.1.  Clorophin không tan trong nước, chỉ tan trong các dung môi hữu cơ. Vì vậy khi muốn tách clorophin ra khỏi lá, bắt buộc phải dùng một dung môi hữu cơ như: ête, cồn hay axeton, …

1.2.2.  Clorophin là este của axit dicacboxilic: C32H30ON4Mg(COOH)2 với hai loại rượu là phyton: C20H39OH và metanol: CH3OH, nên công thức của clorophin có thể viết như sau:

                                              COOCH₃

             C₃₂H₃₀ON₄Mg       

                                             COOC₂₀H₃₉

và khi tác dụng với bazơ sẽ xảy ra phản ứng xà phòng hoá  tạo thành muối clorophinat vẫn có màu xanh.

Ngược lại khi tác dụng với axit thì Mg bị H thay thế và hình thành một hợp chất kết tủa có màu nâu pheophytin.

Nếu cho pheophytin tiếp tục tác dụng với một kim loại khác thì kim loại này lại thay thế vị trí của Mg và tạo thành một hợp chất cơ-kim (hữu cơ - kim loại) có màu xanh rất bền.

1.2.3.  Sự mất màu của clorophin :

           Clorophin trong tế bào không bao giờ bị mất màu, trừ trường hợp bị phân huỷ trong quá trình hoá già của cơ quan, cơ thể. Bởi vì clorophin nằm trong phức hệ cu trúc chặt chẽ với protein và lipoit. Nhưng dung dịch clorophin ngoài ánh sáng và trong môi trường có O2 thì sự mất màu xảy ra do clorophin bị oxi hoá dưới tác dụng của ánh sáng :

Clorophin + hv  ( Clorophin* (trạng thái kích thích)

Clorophin* + O2  ( ClorophinO₂ (trạng thái oxi hoá, mất màu).

 

1.2.4.  Hiện tượng huỳnh quang và lân quang của clorophin

           Khi chiếu ánh sáng vào dung dịch sắc tố rút từ lá xanh và bằng phương pháp đo huỳnh quang, lân quang, ta thấy dung dịch này có hiện tượng huỳnh quang và lân quang. Điều đó chứng tỏ có hiện tượng truyền năng lượng giữa các phân tử clorophin và các loại sắc tố với nhau. Năng lượng của các photon ánh sáng được clorophin hấp thụ đã kích thích các phân tử clorophin và các dạng của các phân tử sắc tố đã truyền năng lượng cho nhau tạo nên hiện tượng huỳnh quang và lân quang. (Huỳnh quang là hiện tượng phát sáng khi chiếu sáng vào sắc tố và sự phát sáng này tắt ngay khi nguồn chiếu sáng tắt. Lân quang là hiện tượng phát sáng khi chiếu sáng vào sắc tố và sự phát sáng này không tắt ngay khi nguồn sáng đã tắt).

1.2.5. Quang phổ hấp thụ của clorophin

           Trong bước sóng ánh sáng nhìn thấy (400 nm - 700 nm), có hai vùng hấp thụ của clorophin: vùng xanh tím (430 nm) và vùng đỏ (680nm). Màu xanh đặc trưng của clorophin và cũng là màu xanh của lá cây chính là kết quả của sự hấp thụ hai vùng quang phổ xanh tím và đỏ này. Vì phổ ánh sáng nhìn thấy (ánh sáng trắng) gồm các vùng ánh sáng: đỏ, da cam, vàng, lục, lam, chàm, tím. Các sắc tố của lá cây hấp thụ các vùng ánh sáng ở đầu và cuối của phổ ánh sáng nhìn thấy để lại ánh sáng vùng lục không hấp thụ (phản xạ hoặc xuyên qua). ánh sáng màu lục đập vào mắt ta khi ta nhìn vào lá cây và thấy lá cây có màu xanh lục (Hình 2).

1.2.6. Clorophin tham gia trực tiếp vào quá trình quang hợp

Năng lượng tích luỹ được bởi clorophin khi hấp thụ ánh sáng được chuyển trực tiếp cho các phản ứng quang hoá để quang phân li H₂O giải phóng O₂, H⁺ và electron và sau đó hình thành 2 sản phẩm vô cùng quan trọng của pha sáng là ATP và NADPH.

THỰC NGHIỆM       

2.1. Rút sắc tố từ lá và thực hiện một số phản ứng lí hoá học của clorophin

2.1.1 Nguyên tắc của phương pháp

Do có nhân Mg trong vòng pyron mang tính tan trong nước và kết hợp với protein màng, trong khi đó đuôi dài cacbon của gốc rượu phytol lại mang tính kị nước và hướng tới cấu trúc lipit của màng tilacoit, nên phân tử clorophin chủ yếu hoà tan trong dung môi hữu cơ. Tuy nhiên để tách tốt clorophin ra khỏi lá, người ta không dùng ête petrol hay benzen, mà dùng cồn hay axeton pha với một ít nước để tách được hết phân tử clorophin từ lá. Các sắc tố của nhóm carotenoit cũng được tách chiết theo phương pháp này.

2.1.2 Đối tượng, hoá chất và dụng cụ thí nghiệm

• • Lá tươi
  • Đũa thuỷ tinh
  • Cồn etilic hoặc axeton 80%
  • Giá ống nghiệm và các ống nghiệm
  • Benzen - KOH 20%
  • KOH 20%
  • HCl 10%
  • Axetat đồng
  • CaCO₃
  • Bột thuỷ tinh
  • Phễu lọc số 3
  • Pipet
  • Kéo
  • ống nhỏ giọt
  • Đèn cồn
  • Giấy lọc
  • Diêm
  • Cối chày sứ

2.1.3 Các bước tiến hành

Lá tươi được cắt nhỏ trong cối sứ (vứt bỏ phần gân lá), thêm một ít bột thuỷ tinh cho dễ nghiền, một ít CaCO3 để trung hoà độ axit của dịch tế bào. Nghiền các mẩu lá cùng với một ít dung môi (cồn hoặc axeton 80% đã chuẩn bị) đến khi thành một thể đồng nhất. Thêm dung môi, rửa chày sứ, dùng đũa thuỷ tinh đổ dung dịch vào ống nghiệm qua phễu lọc.

            Dung dịch sắc tố thu được sẽ được dùng để đo hàm lượng sắc tố và tiến hành một số thí nghiệm nhằm chứng minh các tính chất lí, hoá học của clorophin.

   a. Xác định hàm lượng clorophin

            Đem dịch chiết sắc tố đo trên máy quang phổ ở các bước sóng 663nm, 645nm. Sau đó sử dụng các công thức để tính hàm lượng các sắc tố thành phần như sau:

           Clorophin a (mg/ l):  12,7. OD 663  -  2,69. OD 645

          Clorophin b (mg/ l):  22,9. OD 645  -  4,68. OD 663

Ghi chú: Công thức này sử dụng cho dung môi là axeton 80% ,OD là số đo trên máy quang phổ ở các bước sóng xác định.

            Cũng trên dung môi này, nếu đo ở các bước sóng khác, có thể dùng các công thức khác như:

           Clorophin a (mg/ l): 11,63. OD 665  -  2,39. OD 649

           Clorophin b (mg/ l): 20,11. OD 649  -  5,18. OD 665

           Clorophin a (mg/ l): 11,78. OD 664  -  2,29. OD 647

           Clorophin b (mg/ l): 20,05. OD 647  -  4,77. OD 664

           Sau đây là một vài công thức khác khi sử dụng các dung môi khác nhau:      

- Dung môi axeton 100 %:

           Clorophin a (mg/ l): 11,70. OD 662  -  2,09. OD 644

           Clorophin b (mg/ l): 21,19. OD 644  -  4,56. OD 662

- Dung môi ête êtilic 100 %:

           Clorophin a (mg/ l): 10,1. OD 662  -  1,01. OD 644

            Clorophin b (mg/ l): 16,4. OD 644  -  2,57. OD 662

- Dung môi 96 % êtanol:

Clorophin a (mg/ l): 13,70. OD 665  -  5,76. OD 649

Clorophin b (mg/ l): 25,80. OD 649  -  7,60. OD 665

- Dung môi metanol 100 % :

Clorophin a (mg/ l): 16,5. OD 665  -  8,3. OD 650

Clorophin b (mg/ l): 33,8. OD 650  -  12,5. OD 665 

   b. Quan sát hiện tượng huỳnh quang

           Đặt ống nghiệm chứa dịch sắc tố ra gần cửa sổ có ánh sáng trên một nền đen hoặc gần bóng đèn điện. Quan sát màu của dịch sắc tố ở ánh sáng phản xạ, ta thấy dịch sắc tố có màu đỏ thẫm - màu của rượu vang.

            Đó chính là hiện tượng huỳnh quang của clorophin.

            Hiện tượng huỳnh quang cũng có thể quan sát ở các cây sống. Đối tượng tốt để quan sát là tảo, rêu thuỷ sinh. Các đối tượng này đặt trên lam kính rồi quan sát dưới kính hiển vi bằng ánh sáng xanh tím. Sẽ quan sát thấy clorophin trong lục lạp có màu đỏ thẫm.

   c. Phản ứng với bazơ

           Đổ vào 4 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch sắc tố và tiến hành các thí nghiệm sau:  

            - ống 1 làm đối chứng

            - ống 2 : nhỏ 4 - 5 giọt KOH 20 %, lắc đều, cho thêm  4 giọt benzen, lắc mạnh rồi để yên.

Dung dịch sẽ xảy ra phản ứng xà phòng hoá:

                                   COOCH₃

C₃₂H₃₀ON₄Mg                                   + 2 KOH   à

                                  COOC₂₀H₃₉

                                                                           COOK

                                          C₃₂H₃₀ON₄Mg                             +  CH₃OH + C₂₀H₃₉OH

                                                                           COOK

 

           Muối của clorophin cũng có màu xanh, xong khác với clorophin là không tan trong benzen. Như vậy màu của cồn và benzen khác nhau khi so sánh với đối chứng.

   d. Phản ứng với axit

           Lấy 2 ống nghiệm còn lại, cho vào mỗi ống 2 - 3 giọt HCL 10%, ta sẽ có chất pheophytin có màu nâu xám, vì Mg đã bị thay thế bằng 2 nguyên tử hidro theo phản ứng sau:

                                               COOCH₃

             C₃₂H₃₀ON₄Mg                                          +  HCl    à

                                               COOC₂₀H₃₉

                                            

                    COOCH₃

                                 C₃₂H₃₀ON₄                                   +      MgCl₂

                                                              COOC₂₀H₃₉

          Sau khi quan sát màu của dịch sắc tố, ta lại tiếp tục cho vào một trong hai ống nghiệm dung dịch axetat đồng, sau đó đun sôi dung dịch trên nồi cách thuỷ. Màu nâu xám của dịch lại dần trở lại màu xanh lục đậm. Như vậy liên kết kim loại lại được tái lập, tức là Cu thay thế chỗ của Mg.

            Kết luận: Clorophin là este của axit dicacboxilic.

 2.2 Tách các sắc tố bằng phương pháp sắc kí trên giấy

 2.2.1 Nguyên tắc của phương pháp

            Các sắc tố khác nhau có độ hoà tan khác nhau trong một dung môi nhất định. Do đó khi cho hỗn hợp dung dịch sắc tố lên bề mặt hấp thụ ( ở đây là giấy sắc kí, cũng có thể dùng cột sắc kí với một chất hấp thụ tốt ), các sắc tố sẽ hoà tan trong dung môi và di chuyển cùng dung môi với vận tốc phụ thuộc vào khối lượng phân tử của chúng.

2.2.2 Đối tượng, hoá chất và dụng cụ thí nghiệm

• • Lá tươi
  • Bình sắc kí
  • Đũa thuỷ tinh
  • Bơm hút chân không
  • Giấy lọc
  • Chén thuỷ tinh
  • Cát thuỷ tinh
  • Giấy sắc kí
  • Cối chày sứ
  • Ống đong và các ống nghiệm to
  • Axeton
  • Ete petrol
  • CaCO₃

2.2.3 Các bước tiến hành

Tách chiết sắc tố như bằng phương pháp như ở I. Sau khi có hỗn hợp sắc tố, đổ một ít hỗn hợp này vào chén thuỷ tinh, lấy giấy sắc kí đã chuẩn bị sẵn, nhúng vào dung dịch sắc tố (chú ý cho đều mép giấy, tránh để lệch). Sau vài giây dung dịch sắc tố sẽ thành vệt xuất phát cách mép giấy khoảng 1 - 1,5 cm Tiếp tục nhúng giấy vào dung dịch sắc tố nhiều lần để lượng mẫu ở vạch xuất phát nhiều. Sau đó nhúng mép giấy vào axeton để lôi các sắc tố tập trung về vạch xuất phát. Chờ cho giấy khô và bay hết mùi axeton rồi chuẩn bị sắc kí.

Đổ ete petrol vào bình sắc kí (chiều cao của dung môi khoảng 1cm). Nhúng giấy sắc kí vào dung môi. Giấy sắc kí được cuộn tròn và được giữ hoặc treo sao cho vạch xuất phát của sắc tố không bị ngập trong dung môi mà phải ở trên dung môi và giấy sắc kí không được chạm vào thành bình sắc kí. Để tránh sự oxi hoá sắc tố ngoài ánh sáng, cần đặt bình ở chỗ tối hoặc nơi có ánh sáng yếu. Sau 10 -  15 phút dung môi hoà tan sắc tố, thấm vào giấy, dâng lên theo chiều từ dưới lên trên. Các sắc tố thành phần được tách ra và dừng lại ở các vị trí khác nhau. Nếu chúng ta tách chiết sắc tố của lá cây bằng dung môi axeton, thì kết quả sắc kí sẽ có 4 vạch theo thứ tự từ dưới lên: clorophin b, clorophin a, xanthophin, carote

 KẾT LUẬN

Quang hợp là nguồn duy nhất để tạo ra năng lượng nuôi sống mọi sinh vật trên trái đất; bù đắp lại những chất hữu cơ đã tiêu hao trong quá trình sống; cân bằng khí CO₂ và O₂ trong không khí; quang hợp liên quan đến mọi hoạt động sống kinh tế của con người.

Có thể phân chia vai trò của quang hợp ra làm ba mảng chính:

- Tổng hợp chất hữu cơ: thông qua quang hợp, cây xanh tạo ra nguồn chất hữu cơ là tinh bột là đường glucozo.

- Tích luỹ năng lượng: mỗi năm, cây xanh tích lũy một nguồn năng lượng khổng lồ.

            - Điều hoà không khí: cây xanh khi quang hợp giúp điều hoà lượng hơi nước, CO₂ và O₂ trong không khí, góp phần điều hoà nhiệt độ không khí.

Các giai đoạn chính của quá trình quang hợp :

  * Pha sáng: Pha sáng của quang hợp là pha chuyển hoá năng lượng của ánh sáng đã được diệp lục hấp thu thành năng lượng của các liên kết hoá học trong ATP và NADPH.